虫草多糖对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠脂质过氧化及肝细胞再生的影响

目的:观察虫草多糖对二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝纤维化的药理作用.方法:采用DMN大鼠肝纤维化模型,分为正常组(N,n=6)、模型组(M,n=11)、虫草多糖组(C,n=8)、秋水仙碱组(Q,n=9).造模4周,虫草多糖(60 mg·kg-1)和秋水仙碱(0.1 mg·kg-1)灌胃给药3周,模型与正常组国时给予等量灭菌水.观察血清ALT,AST,GGT活性及Alb,TBil含量;肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量;肝脏病理及胶原染色;肝组织SOD活性及MDA,GSH,GSH-Px含量;肝脏组织增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达.结果:模型组血清ALT,AST,GGT,TBil显著升高,Alb显著降低,虫草多糖组血清AST,TBil显著降低,Alb显著升高;模型组肝组织Hyp显著升高,虫草多糖、秋水仙碱组则显著降低;HE染色:模型组正常肝小叶结构破坏,肝细胞水肿,汇管区结缔组织增生,虫草多糖及秋水仙碱组上述病理变化显著减轻.胶原染色:模型组肝小叶纤维间隔形成,见较多完整假小叶;虫草多糖、秋水仙碱组胶原沉积减少.模型组肝组织SOD,GSH-Px,GSH显著降低,MDA显著增高,虫草多糖及秋水仙碱组GSH,GSH-Px活性显著增高.模型组肝组织PCNA蛋白表达显著升高,虫草多糖及秋水仙碱组则显著降低.结论:虫草多糖可显著抑制DMN诱导的大鼠肝纤维化及脂质过氧化损伤.     

祛湿化瘀方对脂肪肝大鼠脂联素-游离脂肪酸代谢路径的影响

目的：探讨祛湿化瘀方防治脂肪肝的作用及其对脂联素（adiponeetin,ADP）-游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）代谢路径的影响。方法：采用Wistar雄性大鼠,以四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）皮下注射复合高脂低蛋白饮食制备大鼠脂肪肝模型。在造模开始2周后,将40只造模大鼠随机分为模型组和高、中、低剂量祛湿化瘀方组,灌胃用药2周。检测肝组织甘油三酯（triglyceride,TG）、FFA含量;观察肝组织病理变化（苏木精和伊红染色、油红（）染色）;酶联免疫吸附测定检测血清ADP和肝组织脂联素受体2（adiponectin receptor2,AdipoR2）、丙二酰辅酶A（malonyl-coenzyme A,matonyl—CoA）、腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP—activated protein kinase,AMPK）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl—coenzyme A carboxylcqse,ACCase）、肉毒碱脂酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase—1,CPT-1）含量的变化。结果：与正常组比较,模型组大鼠肝组织出现明显大泡样脂肪变性;肝组织TG、FFA、FAS、ACCase和malo—nyl—CoA含量显著升高,血清ADP及肝组织AdipoR2、AMPK和CPT-1含量明显降低。高、中、低剂量祛湿化瘀方均可使脂肪肝大鼠肝脏的病理改变显著减轻,肝组织TG、FFA含量降低;高剂量祛湿化瘀方可使模型大鼠肝组织FAS、ACCase和malonyl—CoA含量显著降低;高、中剂量祛湿化瘀方均能明显升高血清ADP和肝组织AdipoR2、AMPK、CPT-1含量。结论：祛湿化瘀方可通过提高血清脂联素水平,改善低脂联素血症,影响ADP—FFA代谢路径治疗大鼠脂肪肝。     

对中药量效关系的认识和思考

本文阐述了中药剂量与量效关系存在的复杂性与多样性,对中药量效关系进行了详细分析。并指出中药量效关系的研究应该以临床疗效为基础,以中医理论为指导,运用各种现代化科技手段和方法进行多视角、多层面和多学科的系统研究,从而有可能全面系统地揭示中药量效关系的实质和内涵。     

基于黄芪汤益气效应解析代偿期乙肝肝硬化的“虚损”病机理论

中医病因病机理论的继承与创新是中医准确认识疾病、提高中医药临床疗效、引领中医学术发展的关键基础理论问题。基于课题组前期对肝硬化“虚损生积”病机认识以及从方剂效应探析中医病机理论病理特点的研究思路,以黄芪汤为载体开展的系统基础与临床研究发现,“益气补虚”黄芪汤可显著改善代偿期乙肝肝硬化的肝组织学病理变化,减轻肝细胞坏死,改善肝细胞功能,促进早期肝硬化组织学的逆转。黄芪与甘草协同增效的作用机制在于抑制促纤维化因子——转化生长因子（Transforming Growth Factor,TGF）β1生成及信号转导,抑制肝星状细胞的活化及细胞外基质的生成。本文为乙肝肝硬化等慢性肝病的虚损病机理论提供了临床及实验依据,深化和丰富了中医对肝硬化虚损病机中气虚为先的认识;提示气虚与细胞形质转化及其功能的病变有关,为进一步深入研究、提高中医药治疗慢性肝病的临床疗效提供了治法理论基础与临床实践依据。     

Synergistic effect of a novel oxymatrine-baicalin combination against hepatitis B virus replication, α smooth muscle actin expression and type I collagen synthesis in vitro

AIM: To study the effect of oxymatrine-baicalin combination (OB) against HBV replication in 2.2.15 cells and alpha smooth muscle actin (alpha SMA) expression, type I, collagen synthesis in HSC-T6 cells. METHODS: The 2.2.15 cells and HSC-T6 cells were cultured and treated respectively. HBsAg and HBeAg in the culture supernatants were detected by ELISA and HBV DNA levels were determined by fluorescence quantitative PCR. Total RNA was extracted from HSC-T6 cells and reverse transcribed into cDNA. The cDNAs were amplified by PCR and the quantities were expressed in proportion to beta actin. The total cellular proteins extracted from HSC-T6 cells were separated by electrophoresis. Resolved proteins were electrophoretically transferred to nitrocellulose membrane. Protein bands were revealed and the quantities were corrected by beta actin. RESULTS: In the 2.2.15 cell culture system, the inhibitory rate against secretion of HBsAg and HBeAg in the OB group was significantly stronger than that in the oxymatrine group (HBsAg, P = 0.043; HBeAg, P = 0.026; respectively); HBV DNA level in the OB group was significantly lower than that in the oxymatrine group (P = 0.041). In HSC-T6 cells the mRNA and protein expression levels of alpha SMA in the OB group were significantly lower as compared with those in the oxymatrine group (mRNA, P = 0.013; protein, P = 0.042; respectively); The mRNA and protein expression levels of type I collagen in the OB group were significantly lower as compared with those in the oxymatrine group (mRNA, P < 0.01; protein, P < 0.01; respectively). CONCLUSION: OB combination has a better effect against HBV replication in 2.2.15 cells and is more effective against alpha SMA expression and type I collagen synthesis in HSC-T6 cells than oxymatrine in vitro.     

骨髓间充质干细胞移植对四氯化碳大鼠肝损伤的影响及一贯煎的干预作用

该研究观察BMSCs早期尾静脉移植对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)肝损伤模型大鼠的影响以及一贯煎的干预作用。雌性Wistar大鼠65只,随机分为正常组,模型组,细胞移植组,一贯煎组和一贯煎加细胞移植组。造模各组大鼠按3 mL·kg^-1每周2次腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液,共9次;细胞移植组和一贯煎加细胞移植组在首次注射CCl4后立即经尾静脉注入第3代BMSCs 1×10^6个;用药组灌胃一贯煎水煎液。结果可见细胞移植和一贯煎均可降低首次造模48 h的血清ALT和AST。造模4周后,模型组血清ALT,AST,γ-GT活性增高,TBIL含量增高;肝组织SOD活性降低,MDA和TG含量增加;肝组织病理可见大泡型脂肪变性,油红O染色可见大量脂滴,天狼猩红染色未见明显胶原增生,血清TNF-α和IL-6含量升高(P<0.05)。BMSC细胞移植组大鼠肝功能和组织病理较模型组进一步恶化,肝组织可见少量胶原增生,肝组织SOD活性更低,MDA和TG含量进一步增高(P<0.05),血清TNF-α和IL-6含量较模型组升高(P<0.05);经一贯煎干预后,各检测指标均较模型组和细胞移植组有所改善。SRY原位杂交检测显示,BMSC移植后在心、肝、脾、肺、肾均可检测到SRY阳性表达,但以肝脏最多,经一贯煎干预后,SRY阳性细胞在肝脏表达减少。Western blot结果显示正常组高表达Wnt和β-catenin,CCl4造模后表达明显减少,细胞移植后有进一步降低的趋势,一贯煎组干预后则表达增高。该研究表明早期尾静脉BMSCs移植可加重大鼠CCl4肝损伤,促进肝纤维化形成,一贯煎可改善BMSCs移植加重的CCl4肝损伤,其机制与减少BMSCs归巢肝脏,上调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

扶正化瘀方对原代大鼠肝细胞中CYP450的影响

目的:采用原代大鼠肝细胞(PRH)研究扶正化瘀方(FZHY)对大鼠细胞色素P450酶(CYP450)的影响。方法:采用两步灌流法分离大鼠原代肝细胞,形成肝板结构后加入FZHY共培养24 h,换成含有4种CYP450同工酶(CYP1A2,CYP2C9,CYP2D6,CYP3A4)对应的特异性探针药物(非那西丁、甲苯磺丁脲、氢溴酸右美沙芬、睾酮)的培养基,培养2 h后吸取上清液,利用UPLC-MS/MS对探针药物的代谢产物进行检测,考察FZHY对探针药物代谢产物生成量的影响,评价FZHY对PRH中CYP450代谢活力的影响。结果:PRH中CYP1A2,CYP2C9,CYP2D6与CYP3A4具有良好的代谢活力。4种探针药物在0~500μmol·L~(-1)内对PRH没有毒性,在0.5~500μg·L~(-1)时,FZHY对PRH没有毒性。FZHY在5μg·L~(-1)时对PRH具有轻微的保护作用,并能使甲苯磺丁脲的代谢活化值——米氏常数(Km)降低20.8%;氢溴酸右美沙芬的Km降低39.2%;非那西丁的Km降低17.4%;并使睾酮的Km显著降低。结论:FZHY能抑制原代大鼠肝细胞中CYP1A2,CYP2C9,CYP2D6和CYP3A4的代谢活性。     

淫羊藿苷干预核因子NF-κB抑制肝星状细胞活化的研究

目的:研究淫羊藿苷(ICA)对肝星状细胞(HSC)活化的作用,及其对HSC活化过程核因子NF-κB蛋白表达及核转位的影响。方法:肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心方法分离培养大鼠HSC,Alamar blue法观察10-4¹0-8M浓度ICA对4 d的HSC增殖的作用;传代培养的HSC分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)刺激组,ICA组,TGFβ1加ICA组,药物孵育24 h后,Alamar blue法检测HSC增殖,real-time PCR及蛋白印记法检测淫羊藿苷对TGFβ1刺激的HSC内Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,ColⅠ)、平滑肌肌动蛋白-α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NF-κB表达的变化,高内涵药物筛选系统检测HSC内NF-κB核转位的变化特点。结果:10-410-8M浓度ICA对4 d的HSC增殖的作用;传代培养的HSC分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)刺激组,ICA组,TGFβ1加ICA组,药物孵育24 h后,Alamar blue法检测HSC增殖,real-time PCR及蛋白印记法检测淫羊藿苷对TGFβ1刺激的HSC内Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,ColⅠ)、平滑肌肌动蛋白-α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NF-κB表达的变化,高内涵药物筛选系统检测HSC内NF-κB核转位的变化特点。结果:10-4¹0-8M ICA可一定程度抑制HSC的增殖,并且无明显细胞毒作用;10-6M ICA可抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,减少HSC内ColⅠmRNA表达和α-SMA蛋白表达的增加,抑制NF-κB的蛋白表达;减少TGFβ1刺激的HSC内NF-κB核转位。结论:淫羊藿苷可抑制肝星状细胞活化,其机制可能与抑制核因子NF-κB蛋白表达及核转位有关。     

基于胃肠动力调节与透皮吸收探讨中药外用制剂消胀贴膏治疗肝硬化腹水的作用机制

基于"消胀贴膏"敷脐促进肝硬化腹水减退的临床疗效,及该药促进患者排气与减轻腹胀的作用特点,结合胃肠动力影响肝硬化腹水的研究进展,探讨消胀贴膏调节胃肠动力促进肝硬化腹水消退的作用机制及效应物质。首先观察药物敷贴对肝硬化腹水动物胃肠动力、腹内压、肾血流与腹水量的影响及其相关关系;分析药物对模型动物胃肠激素、血管活性因子及胃肠动力调节关键细胞-Cajal间质细胞数量与功能的作用。继之,观察药物对离体胃肠组织平滑肌收缩、对Cajal间质细胞SCF/c-kit信号通路等的影响。最后,分析消胀贴膏的整体动物与离体皮肤透皮入血成分,并评价其影响小肠平滑肌收缩的活性。最终验证"消胀贴膏主要通过促进胃肠动力,从而降低腹内压,增加肾血流量,促进腹水减退,并且具有透皮吸收的效应成分"的科学假说,部分诠释中医"气行则水行"的科学内涵,阐明消胀贴膏外用治疗肝硬化腹水主要作用原理,提高中医药外治法的基础研究水平。